La plupart des gens pensaient que les gènes devaient être constitués de protéines, car les acides nucléiques étaient considérés comme trop simples pour véhiculer l'information génétique. Avery a travaillé toute sa vie sur le pneumocoque et la pneumonie bactérienne. Griffith a montré que la transformation d'une souche non virulente peut être obtenue chez la souris par co-injection de bactéries virulentes tuées par la chaleur. Le laboratoire d'Avery a réussi à obtenir une transformation en éprouvette, mais il a fallu de nombreuses années pour établir un test fiable et finalement purifier la molécule responsable de cet effet, qui s'est avérée être l'ADN. Bien que ces travaux aient été bien connus, la plupart des scientifiques n'étaient pas convaincus de l'implication générale de ce phénomène. En outre, de nombreux biochimistes pensaient que même l'ADN purifié était contaminé par une protéine. Enfin, la transformation était un processus très inefficace et le mécanisme de transformation est resté mystérieux pendant de nombreuses années. Les travaux de Hershey et Chase ont finalement convaincu la communauté scientifique que les gènes sont constitués d'ADN. Nous réalisons aujourd'hui que l'échange d'ADN par transformation est très courant, qu'il participe au transfert horizontal d'ADN entre au moins les espèces bactériennes et qu'il a été un accélérateur considérable de l'évolution

L'origine des mutations a fait l'objet de vives discussions entre les partisans du darwinisme et ceux du lamarckisme. L'enjeu majeur était de définir une approche expérimentale permettant de discriminer sans ambiguïté les mutations survenant au hasard et les mutations causées par l'agent sélectif utilisé pour révéler leur existence. Dans le cas de bactéries devenant résistantes à l'action lytique d'un bactériophage, les hypothèses ont été qualifiées de "mutation vers l'immunité" et d'"immunité acquise". Luria et Delbrück réalisent que les variations observées dans le nombre de bactéries résistantes dans différentes cultures parallèles sont intimement liées à l'hypothèse de la mutation. Cette collaboration exceptionnelle entre un physicien théoricien et un bactériologiste est un exemple parfait de travail interdisciplinaire, alors que ces deux "étrangers ennemis" travaillaient aux Etats-Unis. A cette époque, il n'était même pas clair que les bactéries avaient des gènes et la plupart des travaux de bactériologie n'étaient que descriptifs. L'utilisation d'une approche quantitative a permis aux auteurs de trancher la question. Le test de fluctuation est un outil très puissant pour calculer les taux de mutation. Peu après, Newcombe a réalisé une expérience simple mais élégante pour démontrer que l'augmentation du nombre de bactéries résistantes détectées lors d'une expansion clonale reflète à la fois l'amplification de mutants préexistants et l'apparition continue de nouvelles mutations

Lorsqu'on a découvert que l'ADN était le matériel génétique, on ne savait pas comment cette molécule pouvait transporter l'information. La structure de l'ADN est donc devenue d'une importance capitale. Les images aux rayons X obtenues par M. Wilkins et R. Franklin ne donnaient qu'une image approximative, et même R. Franklin, qui disposait des données de diffraction les plus claires, ne pouvait pas décider si les molécules contenaient deux ou trois brins. Tant Pauling que Watson et Crick ont utilisé des modèles moléculaires avec des distances inter-nucléaires (longueur des liaisons) et des angles de liaison connus pour prédire une structure. Alors que le modèle de Pauling n'était guère réaliste, puisqu'il utilisait la forme protonée du phosphate, le modèle proposé par Watson et Crick proposait que l'ADN soit constitué d'une paire de brins d'ADN. En outre, il indiquait que n'importe quelle séquence de nucléotides pouvait être prise en compte dans la structure. La seule question biologique centrale abordée dans le premier article était la réplication, et la célèbre phrase n'était en fait rien d'autre qu'une revendication de priorité. Le deuxième document abordait beaucoup plus de questions biologiques. Il était supposé que l'appariement des bases était suffisant pour expliquer la fidélité de la réplication. L'importance de l'ADN polymérase dans la fidélité de la réplication a été démontrée pour la première fois par Speyer.

Avant les expériences de Benzer, la plupart des cartographies génétiques nécessitaient le criblage de tous les descendants d'un croisement pour calculer les fréquences de recombinaison. La puissance du système rII du phage T4 réside dans le fait que de nombreux mutants indépendants peuvent être identifiés en notant la morphologie de la plaque sur la souche hôte permissive, et que seuls les recombinants de type sauvage se développent sur la souche hôte restrictive. Cette caractéristique, associée à la très forte recombinaison de l'ADN T4, permet de détecter la recombinaison entre des mutations affectant des nucléotides adjacents. Le test de complémentation cis-trans a montré que le locus rII est constitué de deux gènes. En utilisant plus de 100 mutants de délétion, qui ne reviennent pas au type sauvage, Benzer a d'abord démontré que la topologie de l'ADN est linéaire. En utilisant ces délétions, il a pu découper les gènes rIIA et rIIB en 47 segments. Un test de recombinaison très simple et rapide lui a permis de cartographier des milliers de mutants ponctuels, indépendants ou induits par des mutagènes, dans des segments individuels. Cette carte était parfaitement cohérente avec les cartes laborieusement construites par des tests de recombinaison classiques. La topographie de la carte était étonnamment non aléatoire, avec des sites qui sont 100 fois plus susceptibles de muter que d'autres et qui sont appelés "points chauds". Le spectre des sites détectés après mutagenèse était étonnamment différent. On sait aujourd'hui que la plupart des mutants rII spontanés sont des décalages de trame, c'est-à-dire des ajouts ou des suppressions d'une ou de quelques paires de bases qui perturbent la traduction de l'ARNm en protéine. En revanche, la plupart des mutagènes utilisés dans ce travail induisent des substitutions de bases qui n'interrompent généralement pas la traduction. Maintenant que la séquence du locus rII est connue, la saturation de la carte est telle qu'il y a environ une mutation tous les 8 nucléotides.

Benzer et Champe ont étudié les propriétés des délétions qui couvrent la frontière entre rIIA et rIIB. Comme on pouvait s'y attendre, la plupart d'entre elles ne peuvent assurer aucune des deux fonctions pendant l'infection d'une souche non permissive. Une délétion était cependant très inhabituelle et était toujours capable d'assurer la fonction rIIB même s'il lui manquait 10 % des sites rIIB. Cette délétion a permis de confirmer la nature générale du code génétique proposé par Crick et al. Dans la discussion, les auteurs évoquent la notion d'enzymes bi-fonctionnelles telles que la tryptophane synthase. Chez les bactéries, les deux activités catalytiques sont réalisées par des protéines individuelles codées par des enzymes adjacentes. Chez les eucaryotes, les deux réactions sont réalisées par une seule protéine : le produit de la première réaction ne diffuse pas vers l'extérieur mais est "canalisé" dans le second site actif. Il ne s'agit là que d'une exception au modèle "un gène, une enzyme" discuté lors de la première session. Crick et al. commencent leur article en présentant les preuves que le code ne doit pas se chevaucher. L'une de ces preuves, fournie par Brenner, est le travail fondateur de ce qui deviendra la bio-informatique. À partir d'une seule mutation de décalage du cadre de lecture de rIIB, dont on sait aujourd'hui qu'elle implique l'ajout d'une seule paire de bases qui déplace le cadre de lecture de l'ARNm, ils isolent de nombreuses mutations suppressives intragéniques qui rétablissent la fonction de rIIB. La mutation originale est affectée d'un signe + et ses suppresseurs d'un signe -. Ils isolent ensuite des suppresseurs de ces suppresseurs qui sont eux-mêmes des mutants +. Toutes les combinaisons testées de deux mutations + et deux mutations - n'ont pas de fonction rIIB. La plupart des combinaisons d'une mutation + et d'une mutation - ont une fonction rIIB ; les autres combinaisons sont censées générer un codon stop entre les deux décalages de trame. Enfin, un certain nombre de mutants triples se sont révélés avoir une fonction rIIB. Ils utilisent la délétion inhabituelle qui fusionne les deux gènes rII pour démontrer que les mutations par décalage de trame situées dans la partie rIIA du gène fusionné abolissent sa fonction rIIB. L'interprétation la plus simple est que les mutants + ont une paire de base de plus (ou de moins) et que les mutants - ont une paire de base de moins (ou de plus). Bien que la nature générale du code soit de 3n paires de bases par acide aminé, ils pensent que le code est un code à trois lettres plutôt qu'à six lettres

L'existence de codons non-sens ou stop a été suggérée par le phénotype mutant de certaines combinaisons de doubles mutants (+-) (voir session précédente). Benzer avait observé que certains mutants rII peuvent se comporter comme le type sauvage dans certaines souches restrictives qui, par exemple, ne permettent pas la croissance des mutants rII de délétion et de décalage du cadre ; il a appelé ces mutants des mutants rII ambivalents et les souches des suppresseurs. Dans le premier article, il a de nouveau utilisé la délétion qui fusionne rIIA et rIIB tout en préservant la fonction de rIIB. Des mutations réversibles d'analogues de base dans la région N-terminale de rIIA ont été combinées avec la délétion. Certaines de ces mutations, appelées mutations faux-sens, n'affectent pas la fonction rIIB du gène fusionné. D'autres, au contraire, abolissent sa fonction rIIB dans les souches restrictives mais pas dans les souches suppressives. Une des conclusions majeures de ce travail est que le code génétique est sous le contrôle génétique de l'organisme lui-même. Ce contrôle est réalisé par les gènes qui codent les ARNt et les synthétases d'acides aminés de l'organisme. Brenner discute les résultats observés dans plusieurs systèmes bactériens et viraux qui décrivent les mutations non-sens et leurs suppresseurs bactériens. Ils proposent une nomenclature unifiée pour les mutations ambre et ocre. Ils montrent que les suppresseurs ambre ne suppriment que les mutations ambre alors que les suppresseurs ocre, qui sont généralement faibles, suppriment à la fois les mutations ambre et ocre. Les résultats variables obtenus avec différents suppresseurs s'expliquent par la nature de l'acide aminé inséré par chaque suppresseur ainsi que par des effets de contexte. Le principal mutagène utilisé dans ce travail est l'hydroxylamine, qui peut modifier les résidus C de manière à ce qu'ils soient reconnus comme T lors de la transcription et de la réplication. Comme les gènes rII doivent être exprimés avant la réplication, un C modifié n'exercera son effet que s'il est présent sur le brin d'ADN qui est transcrit. En utilisant l'hydroxylamine, ils montrent que ni les mutants ambre ni les mutants ocre ne peuvent être induits à se réverser avec l'hydroxylamine, que ce soit immédiatement ou après un cycle de croissance sur une souche permissive. Comme l'ocre peut être converti en ambre par traitement à la 2-aminopurine, un mutagène analogue à une base, les deux codons doivent avoir deux bases communes (UAx) et la troisième diffère par une transition (UAG versus UAA). Dans une brillante chasse aux mutations ambre et ocre induites par l'hydroxylamine, ils montrent que les deux codons doivent avoir un U et un A. Ces données génétiques sont combinées avec l'étude biochimique des protéines produites soit par suppression des mutants ambre, soit par réversion de ces mutants induite par le mutagène. Les données correspondent parfaitement au décryptage biochimique du code effectué par Nirenberg et al

Le phage T4 est le premier organisme dont tous les gènes essentiels ont été décrits. Cela a été possible grâce à l'utilisation de deux types de mutations létales conditionnelles qui peuvent se produire dans pratiquement n'importe quel gène. Les mutations Amber introduisent le codon stop UAG. Deux facteurs contribuent à l'utilisation générale des mutations ambre. De nombreuses souches dérivées de la souche originale K-12 sont porteuses de suppresseurs d'ambre et leur efficacité est très élevée. Les mutations sensibles à la température ne permettent la croissance qu'à la température permise. Elles se produisent dans la plupart des protéines qui se déplient à la température restrictive et sont souvent dégradées ; elles se produisent également dans les gènes d'ARNt, où elles déstabilisent la structure en empêchant l'appariement des bases. Les cellules infectées dans des conditions non permissives ont été analysées par biochimie et par microscopie électronique. Les mutations qui empêchent la réplication de l'ADN viral empêchent toutes la synthèse des composants viraux ; elles définissent les gènes T4 précoces. Les mutations dans les gènes de structure permettent la réplication de l'ADN mais empêchent l'apparition d'un ou plusieurs composants du phage. Cependant, les mutations dans les gènes de tête permettent la formation de queues et de fibres et réciproquement, les mutants de queue accumulent des têtes et des fibres. Lorsque les particules sont incubées avec un extrait contenant des fibres mais pas de têtes (ou pas de queues), les composants se réassemblent rapidement, spontanément et efficacement pour donner des particules virales infectieuses. Les extraits issus d'infections mutantes peuvent être classés comme donneurs de têtes ou donneurs de queues. Dans tous les cas, le génotype du virus actif est déterminé par les têtes, comme prévu. Ces expériences ont permis de définir le processus d'assemblage du phage T4 : trois lignes d'assemblage indépendantes (tête, queue et fibre) convergent pour former un virus infectieux. Elles ont également fourni un test fonctionnel pour la purification des composants structurels du phage.

Bien que de nombreuses tentatives aient été faites pour identifier la recombinaison chez les bactéries, ce n'est que lorsque Lederberg et Tatum ont commencé à utiliser des souches ayant des besoins auxotrophiques multiples que le retour à la prototrophie a été suffisamment réduit pour permettre la détection sans ambiguïté des recombinants. La souche K-12 originale porte l'épisome F, un plasmide qui code toutes les fonctions nécessaires au transfert d'ADN entre les cellules. Heureusement, de nombreuses souches dérivées de la souche K-12 ont perdu l'épisome F et peuvent recevoir l'ADN d'une souche donneuse. La différence entre ce système d'échange d'ADN, appelé plus tard conjugaison, et la transformation a été clairement démontrée. Les tentatives de cartographie des mutations sur le chromosome d'E. coli n'ont pas été couronnées de succès, essentiellement parce que la fréquence de recombinaison était extrêmement faible. L'isolement de souches mâles Hfr (pour une fréquence de recombinaison élevée) par Cavalli-Sforza et Hayes a constitué une amélioration considérable pour la cartographie des chromosomes. En effet, il était désormais possible d'obtenir une fréquence de recombinaison reproductible. En utilisant un mixeur pour séparer les paires d'accouplements, Wollman et Jacob ont pu déterminer le temps de contact minimum nécessaire pour qu'un marqueur donné soit transféré d'un donneur à un receveur. Lorsque les accouplements impliquaient une souche lysogène pour le phage lambda, il y avait une différence frappante en fonction de la souche lysogène. Lorsque la souche réceptrice était lysogène, rien ne se passait dans les cellules d'accouplement. En revanche, lorsque la souche donneuse était lysogène, la receveuse commençait à produire des particules virales avec une grande efficacité. Dans ce système, plus de 50 % des cellules réceptrices pouvaient être amenées à produire des phages lors de l'accouplement. Enfin, les paires d'accouplement étaient suffisamment fréquentes pour être observées au microscope électronique et un petit pont cellulaire a été détecté entre les cellules receveuses et les cellules donneuses

Lorsque des bactéries sont cultivées en présence de glucose et d'un autre sucre comme le lactose, elles utilisent d'abord le glucose. Lorsque le glucose est épuisé, elles commencent à utiliser le second sucre après un court délai. Ce phénomène est appelé adaptation. Les enzymes métabolisant le lactose sont essentiellement absentes pendant la première phase de la croissance diauxique et sont induites en présence de lactose. Il existe des mutants, appelés mutants constitutifs du lactose, qui expriment toujours la β-galactosidase. Monod et ses collègues ont utilisé la conjugaison pour déterminer le mécanisme de la synthèse de l'enzyme et de son induction. Ils ont montré que la conjugaison n'implique que le transfert du matériel génétique du donneur au receveur, sans transfert détectable du cytoplasme. Lors du transfert d'une région lactose de type sauvage dans un récepteur constitutif mais dépourvu du gène lacZ, le récepteur commence à exprimer la β-galactosidase de manière constitutive. Après deux heures, l'accumulation de l'enzyme s'arrête en l'absence d'inducteur mais continue en sa présence, ce qui indique que les cellules ont maintenant acquis le phénotype inductible de type sauvage. La recombinaison se produit dans ces cellules, mais sa contribution aux phénotypes du lactose n'est pas pertinente. La similitude entre le contrôle des gènes lac et celui de la lysogénie avec le phage λ a permis de convaincre les auteurs de la signification générale de leurs résultats. Dans la courte note de Jacob et al, les auteurs ont pu utiliser des diploïdes partiels stables. Ils isolent une autre classe de mutants constitutifs, dans l'opérateur. La plupart des mutations constitutives se situent sur le gène i qui contrôle la synthèse d'un répresseur, un gène régulateur, et elles sont récessives. En revanche, les mutants dans l'opérateur sont dominants en cis. Bien que l'existence d'un promoteur aurait pu expliquer le phénotype des "délétions physiologiques", il a été démontré plus tard qu'il s'agissait de mutants lacZ polaires qui empêchent l'expression du gène lacY adjacent. En l'espace de deux ans, les auteurs construisent une théorie approfondie de la régulation négative de l'expression des gènes. L'étude du système lactose a été grandement facilitée par un certain nombre d'analogues du lactose qui permettent de séparer l'induction de l'utilisation du substrat. La propriété du répresseur du lactose a conduit au concept d'allostérie.

Le principal point de départ de l'histoire moderne de la lysogénie, écrit par Lwoff et Guttman, n'est pas disponible en anglais. Nous commencerons cette session par l'étude de Bertani sur la souche Li d'E. coli qui porte 3 prophages lysogènes. Chaque prophage peut être induit indépendamment des deux autres, et le taux relatif d'induction spontanée dépend de l'état physiologique des cellules. Bertani a mis au point une méthode pour détecter des salves uniques et a pu calculer que le taux d'induction est d'environ 1 pour 50000 cellules par génération, un taux bien inférieur à celui observé par Lwoff avec le prophage B. megatherium.Après un bref aperçu de la régulation du phage lambda, nous discuterons du phénotype létal d'un prophage thermo-inductible qui ne peut pas s'exciser du chromosome. Les répresseurs de ce phénotype appartiennent à deux classes principales : les mutations dans les gènes O ou P empêchent la réplication du phage, tandis que les mutations x empêchent l'expression de l'opéron précoce qui comprend O et P. Lors du passage à la température élevée, le répresseur est inactivé. Si les cellules sont incubées à la température élevée pendant plusieurs générations et ramenées à la température permissive où le répresseur peut être actif, les mutants x récupèrent lentement leur immunité alors que les mutants O et P restent définitivement non immunisés. Nous savons maintenant que les mutations x inactivent un opéron précoce qui contient O et P. Ces mutations ont été appelées "délétions physiologiques". Le phénotype des mutants x est récessif, ce qui constitue la première preuve de l'existence de Cro, un nouveau gène de l'opéron x-O-P. Les mutants qui ne fabriquent pas Cro présentent des signes d'immunité. Des mutants qui ne fabriquent pas Cro ont été isolés. Contrairement aux phages de type sauvage qui activent préférentiellement le programme lytique, les mutants cro sont incapables de former des plaques parce que la lysogénie est le programme préférentiel. Cro réprime également l'autre opéron précoce puisque son expression est augmentée à la fois chez les mutants x et cro

Le système de l'arabinose représente la première démonstration d'une régulation positive de l'expression génétique. Les premiers mutants araC ne synthétisent aucune des enzymes cataboliques codées par les gènes araBAD adjacents. Ils n'expriment pas non plus AraE, la principale perméase de l'arabinose, dont le gène est situé de l'autre côté du chromosome bactérien, loin du locus araCBAD. Dans cet article, Engelsberg et al. isolent et caractérisent des mutants constitutifs. Ils montrent tout d'abord que tous les mutants constitutifs et négatifs de l'araC sont liés au même gène. Ils démontrent une expression coordonnée de toutes les enzymes de l'arabinose testées, y compris la perméase située à distance ; cette expression est spécifique puisque le niveau d'une enzyme non apparentée et d'une perméase du glucose n'est pas affecté. En utilisant des diploïdes partiels, ils montrent que les mutants araC négatifs sont récessifs à la fois par rapport au gène normal et aux mutants constitutifs. Ce travail de pionnier sera mis en perspective avec les connaissances actuelles sur la régulation de l'enzyme arabinose, notamment le fait qu'AraC est également un répresseur et que la répression implique des boucles d'ADN entre des sites distants.